实时荧光定量PCR仪的选购指南
2012-06-19
PCR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪，生物通将在随后为大家介绍。
温度控制
对普通PCR仪来说，温度控制指标主要是指温度的准确性、均匀性、以及升降温速度，对梯度PCR仪来说，除了温度的准确性和均匀性、升降温速度以外，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。
温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性，它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的问题，对于PCR反应而言最重要的莫过于温度控制的准确性，由于PCR是一个几何级数扩增的过程，扩增过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，对退火温度而言温控显的尤为重要，有时1度甚至0.5度的差异也能决定实验的成功与失败，所谓差之毫厘，谬之千里。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。
温度的均匀性是指样品孔间的温度差异，它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。z6尊龙凯时在实验中发现有时用同样的样品，同样的PCR反应程序，最后的结果竟然差异非常明显，或许就是因为不同位置的温度不均一性所致。一些使用过早期PCR仪的脑子格外灵光的研究人员偏爱使用PCR仪中间某几个固定的孔，就是因为过往反复的教训和认真的思索得出了这样的结论，PCR仪的温度均匀性不好，特别是最外周的样品孔情况更差，很有可能影响实验结果——即“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。正是这种位置效应对定量PCR的结果的影响更为明显，所以后来才有Roche和Cobbett的离心式定量PCR的重大创新。
温度控制除了精确度，还有一个厂家喜欢大力宣传的指标——升降温的速度。更快的升降温速度，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，能提高PCR反应煌特异性。因此从本质而言温控方式就从以前相对稳定耐用的机械式转向了升降温更快速的半导体。除了机械本身的原因，影响升降温速度的还有制作承托样品管的基座模块的材料的导热性。例如ABI早就有升降温速度高达5°C的黄金基座(不要误会，是银质镀金而已，要是足金在哪儿可都长久不了)，最近eppendorf也推出了升降温速度可达到6℃/秒和4.5/秒的银质模块,是目前同类产品中升降温速度最快的，据厂家资料，一个在其他仪器上原本需要需要40—60分钟的PCR反应，eppendorf Mastercycler ep(银质模块)只需运行28分钟——别小看这节约下来的几十分钟，一天下来就可以多运行好几轮了。而真正常用而经济的材料是铝合金。
作为用户来说，当然更愿意选择升降温速度快的，这就像汽车上好看的表面配置一样容易看到，而内在的稳定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必须注意到，仪器的升降温速度和样品管中的样品的升降温速度并非同一回事，因为样品管与基座接触的紧密性、导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。
现在的PCR仪如ABI,Eppendorf的一般具有两种温控模式，即模块温控模式(Block-control)和反应管温控模式)(tube-control)。在模块温控模式下，机器根据探测器直接探测的温控模块(即承载样品的金属台)的温度进行控制，这种模式适用于长时间的静态孵育(如连接、酶切、去磷酸化等)。反应管温控模式实际上是一种模拟试管/PCR板的温控模式，根据探测器所探测到的温控模块的温度由计算机计算出管内/PCR板孔内样品液的温度来进行控制。一般说来，试管温控更为准确，因为管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度。
特别是PCR反应中的孵育过程一般都很短暂(30秒或更短)，如果采用只有模块温控模式的话，反应混合物孵育的时间与程序设定的时间会有相当大的差距。而反应管控制精确的算法能自动补偿时间，而且适合各种类型的反应管，确保反应混俣物按照程序设定的时间维持预设温度。这里要表扬的是ABI——因为他们的宣传资料很老实的指出，模块升降温速度高达3.5℃，样品的实际平均升降温度是1℃左右，而且ABI的PCR仪中显示的温度也是计算出来的样品温度而非温控模块的温度。z6尊龙凯时看到过有的品牌代理做的宣传资料中故意引用ABI的“样品实际平均升降温速度”去和自己的模块升温速度比较，未免有失公允。
有的PCR仪厂家推出了另一种温控方式;热敏电极温控模式。该方法将一个热敏电极插入一个专门的测量管中(管中装有矿物油)，反应进行时，将该测量管插入温控模块的样品进行检测。他们认为通过此途径可以监测反应管内样品的实际温度，但这种方法未免有些华而不实;(1)测量管中矿物油的温度变化与实际反应样品的温度变化未必一致;(2)因为测量管必须占用一个样品孔，所以使用该温控方式时就无法使用96孔PCR板作实验。
梯度PCR
对于一个PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算最适的退火温度，可是由于模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能"P"出来结果，细微的变化对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间提高效率，又节省实验成本。
对于带梯度功能的PCR仪，需要考虑梯度模式下不同梯度管排间的温度均匀性和准确性，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。这种差异可能导致在梯度模式下得出的最佳条件与标准模式下单独做的结果出现差异。SteadySlope技术是eppendorf拥有的梯度PCR技术专利，可以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度，所以在梯度模式下具有恒定的温度性。这一技术保证了在梯度模式和普通模式之间可以进行可靠的信息传递，不会因为温度特性不同而导致产量和特异性的变化。MJ公司没有付专利费而选择在梯度模式下采用不同的降温速率，每个梯度温度之间的温度曲线不同，从梯度模式向普通模式进行转换的可能会出现问题。此外采用TCT(三组回路)技术的梯度PCR仪由于在梯度PCR模式下增加了一个加热和冷却的控制区域，保证了梯度温度控制的精确性并使不同梯度管排间的温度均匀性更好。
在PCR仪上增加原位PCR模块就可以在玻片上进行原位PCR扩增，MJ和eppendorf的PCR仪都有提供原位适配器以满足不同需要。购买配有支持原位PCR模块的PCR仪对从事医学研究的工作者是很值得的，一机两用。
此外，随着基因组高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR仪，各有特长：MJ有一种一拖四，就是1个主机带4个扩增槽，每个槽可以独立控温，一次可以作96x4个样品的PCR，不过一旦出现问题4个都不能用了。ABI则在原来的9700的基础上推出了双384孔的基座，一次完成384x2个样品，使得9700的功能又扩展到高通量领域而无需购买新的机器，可惜两个384槽不能独立控温。eppendorf则有一个控制面板，可以控制5个独立的PCR仪，每台机器可以联合，而且互不影响，但是比较浪费空间。
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