荧光定量PCR仪技术及其在医学中的应用(一)
2012-06-19
1 概述
荧光定量多聚酶链式反应是一种新的核酸定量技术。该技术将荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)应用于常规多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR仪中,从而进行定量检测。FRET即是通过受体发色团之间偶极一偶极相互作用,能量从供体发色团转移至受体发色团,转移效率与曲个发色团之间距离的6次幂倒数成比例。与普通定量PCR相比,荧光定量PCR仪具有可实时监测、准确性高、效率高等优点,本文综述目前国内外几种荧光定量PCR仪技术及应用。
2 荧光定量PCR 方法
2.1 TagMan
TagMan技术是利用Tag酶5 外切酶活性,即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性,能够裂解双链DNA5 端核苷酸,释放出单个或寡核苷酸,裂解的最佳底物是被置换了的具有又样结构的单链DNA,水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Tag酶的这种活性,设汁合成一个能与PCR产物杂交的探针,该探针的5 端标记一个荧光分子.3 端标记另一个荧光分子。其中3 端荧光分子能够吸收5 端荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到3 端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板)时,该针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Tag酶5 外切酶活性,将探针5 端连接的荧光分子从探
针上切割下来,破坏了两荧光分子间的FRET,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。因此,根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的量。其主要不足是:
2.2 Molecular beacon
分子信标技术(molecular beacon)也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子,与Tag Man探针不同的是,该探针5 和3 末端自向形成8个碱基左右的发卡结构,此时荧光分子和淬灭分子邻近,因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时,该探针与模板杂交,从而破坏了探针的发卡结构,于是溶液便产生了荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。该方法的特点是采用非作为淬灭分子,荧光本底低 其不足之处是:(1)杂交时探针不能完全与模板结合,稳定性差;(2)探针合成时标记较复杂
近来,基于Molecular beacon的原理,人们对其进行改进,使用了一种发卡式引物(sunrise primer).此法能将所有扩增产物均标记上荧光分子,因此荧光信号响应快。但无法区分特异和非特异扩增是致命不足 为了克服不足,人们义对其进行改进,发明了一种称为蝎状引物(scorpion primer)的荧光定馈PCR技术。该技术在引物与Molecular beacon探针之间连接一个间隔臂,使PCR延伸反应时不能够延伸至Molecular beacon分了 这样,非特异扩增产物便无荧光信号,但当有物异扩增产物时, 即可与Molecular beacon进行分了内杂交, 产生荧光信号既解决了非特异问题,又保留了响应快的特点。但仍存在杂交时, 探针不能完全与模板匹配及合成复杂的问题.
2.3 Amplisensor
Amplisensor是一种复合探针技术,一个探针上连接一种荧光物,另一探针连接一种淬灭物。 探针长度不同,其中淬灭物标记探针5 端多出7个碱基(GCGTCCC)。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接,PCR仪引物的5 应有一段与长探针互补的序列. 以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针一引物复合物作为半套式引物掺入模板,从而释放淬灭探针部分,破坏了荧光能量传递,产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法主要特点:(1)采用半套式PCR扩增,提高了灵敏度,但无法区分引物二聚体形成产生的非特异扩增信号,使定量准确度受到影响;(2)每次PCR扩增前,要先进行Amplisensor的标记,增加了操作步骤和检测成本;(3)中间需加入半套式引物,增加了污染机会。
2.4 Lightcycler
Lightcycler是新近发展起来的一种定量PCR技术,该技术将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上,形成发光探针和淬灭探针,发光探针的5 端与淬灭探针的3 端分别连接荧光分子。两探针设计为可与模板同一条链相邻的序列杂交,杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻,从而发生FRET使荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比,以此进行定量分析。该方法淬灭效率高,但由于两个探针结合于模板上,因此影响扩增效率。此外,由于需合成两个较长探针,合成成本较高。
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